항산화 능력 평가 프로토콜

1. DPPH 라디칼 소거능 (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)

1. 준비

 • 3.94 mg의 DPPH를 100 mL의 95% 에탄올에 녹여 0.1 mM 농도의 DPPH 용액¹⁾을 준비한다.

 • 용액을 사용 전 30분 동안 빛을 피해 실온에서 안정화시킨다.

 • 표준 곡선을 그리기 위해 샘플 및 1mg/mL 아스코르빈산 용액을 1/2배로 여러번 희석하여 준비한다.

2. 반응 혼합

 • 96well plate에 100 µL의 DPPH 용액 + 100 µL의 샘플 용액(혹은 아스코르빈산)을 넣는다.

 • 대조군으로는 100 µL의 DPPH 용액 + 100 µL의 95% 에탄올 용액을 넣는다.

3. 흡광도 측정

 • 마이크로플레이트 리더를 사용하여 517 nm 파장에서 흡광도를 측정한다.

4. 결과분석

 • DPPH 소거능을 계산한다. (%) = [(A³⁾_대조군 – A_샘플) / A_대조군] × 100

 • 표준 곡선을 통한 IC50⁴⁾을 구한 뒤 아스코르브산과 비교하여 항산화 능력을 평가한다.

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 • 1) DPPH는 빛에 민감하기 때문에 모든 실험은 차광된 상태에서 진행해야 한다.

 • 2) DPPH 라디칼은 샘플에 의해 환원되면 색이 보라색에서 옅은 노란색으로 변화한다.

 • 3) A, Abs, Absorbance, 흡광도

 • 4) IC50, Inhibitory Concentration 50% = 샘플이 DPPH 라디칼의 50%를 소거하는 데 필요한 농도

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 • 필요시약

1. DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)

2. 아스코르빈산(Ascorbic Acid)

3. 95% 에탄올

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2. ABTS 라디칼 소거능 (2,2′-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))

1. 준비

 • 7mM ABTS용액을 제조한다. (548.68g/mol 기준 3.84mg/mL, 증류수)

 • 2.45mM 포타슘 퍼설페이트 용액을 준비한다. (270.32g/mol 기준 66.17mg/100mL, 증류수)

 • ABTS용액 및 포타슐 퍼설페이트 용액을 1:1의 비율로 혼합한 ABTS•+ 용액을 실온에 12h이상 보관한다.

 • 마이크로플레이트 리더 734nm 파장의 흡광도가 0.7±0.02가 되도록 증류수로 희석한다.

 • 표준 곡선을 그리기 위해 샘플 및 1mg/mL 아스코르빈산 용액을 1/2배로 여러번 희석하여 준비한다.

2. 반응 혼합

 • 96well plate에 200 µL의 희석된 ABTS•+ 용액 + 10 µL의 샘플 용액(혹은 아스코르빈산)을 넣는다.

 • 대조군으로는 200 µL의 희석된 ABTS•+ 용액 + 10 µL의 95% 에탄올 용액을 넣는다.

3. 흡광도 측정

 • 마이크로플레이트 리더를 사용하여 734nm 파장에서 흡광도를 측정한다.

4. 결과분석

 • ABTS•+ 소거능을 계산한다. (%) = [(A³⁾_대조군 – A_샘플) / A_대조군] × 100

 • 표준 곡선을 통한 IC50⁴⁾을 구한 뒤 아스코르브산과 비교하여 항산화 능력을 평가한다.

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 • 1 ) ABTS•+은 빛에 민감하기 때문에 모든 실험은 차광된 상태에서 진행해야 한다.

 • 2) ABTS•+은 샘플에 의해 환원되면 청록색이 점점 옅어진다.

 • 3) A, Abs, Absorbance, 흡광도

 • 4) IC50, Inhibitory Concentration 50% = 샘플이 DPPH 라디칼의 50%를 소거하는 데 필요한 농도

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 • 필요시약

1. ABTS(2,2′-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))

2. 포타슘 퍼설페이트(Potassium persulfate, K2S2O8)

3. 아스코르빈산(Ascorbic Acid)

4. 95% 에탄올

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3. DPPH/ABTS 라디칼 소거능 비교

1. 공통점

 • 항산화제의 색이 변화하는 것을 측정하여 라디칼 소거 능력을 평가한다.

 • IC50 값을 사용하여 아스코르빈산과 항산화 능력을 비교한다.

2. 차이점

 • 517 nm에서 흡광도가 측정되며, 주로 유기 용매(에탄올, 메탄올)에서 실험이 진행된다.

 • 734 nm에서 흡광도가 측정되며, 수용성 및 알코올 환경에서 실험이 가능하다.

3. 장단점

DPPH		ABTS
장점	단점	장점	단점
실험절차가 간단하고 빠름	수용성 항산화제 평가에 부적합	수용성 및 지용성 모두 평가 가능	준비 시간이 비교적 김
지용성 항산화제 평가 가능		다양한 용매 사용 가능	실험 과정이 비교적 복잡함