Cell Staining 프로토콜
- Hematoxylin & Eosin (H&E) Staining
- Alcian Blue Staining
- Safranin-O Staining
- Oil Red-O Staining
1. Hematoxylin & Eosin (H&E) Staining
1. 준비
a. Hematoxylin Solution
• Hematoxylin을 증류수를 이용하여 0.5%의 농도로 용해한다. (0.5g/100mL)
• Aluminum sulfate를 5%의 농도로 추가하여 용해한다. (5g/100mL)
• 혼합된 Hematoxylin 용액을 70°C 항온조에 24시간 보관한다.
• 필터를 통해 불순물을 제거한 뒤 만들어진 Hematoxylin 용액을 차광된 상태에서 실온에 보관한다.
b. Eosin Solution
• Eosin을 95% Ethanol을 이용하여 1%의 농도로 용해한다. (1g/100mL)
2. 탈파라핀화
• 슬라이드를 자일렌에 1분씩 2회 담가 파라핀을 제거한다.1)
• 재수화를 위해 100, 90, 80, 70% 에탄올 및 증류수에서 각각 2분간 담가 세척한다.
3. 염색
• 슬라이드를 Hematoxylin 용액에 3분간 담가 염색한다.
• 염색 후 증류수에 2분간 담가 세척한다.
4. 대조 염색
• 슬라이드를 Eosin 용액에 3분간 담가 염색한다.
• 염색 후 증류수에서 2분간 담가 세척한다.
5. 탈수 및 봉입
• 탈수를 위해 70, 80, 90, 100% 에탄올 및 자일렌에서 각각 2분간 담가 세척한다.2)
• 자일렌이 완전히 마르기 전 소수성 봉입제를 사용하여 봉입한다.
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• Hematoxylin을 통한 파란색으로 핵을 염색
• Eosin을 통한 분홍색으로 세포질 및 기타 구조를 염색
• 1) 크라이오 섹션을 통해 샘플을 만든 경우 자일렌의 과정 없이 재수화를 진행한다.
또한 자일렌이 완전히 제거되지 않은 경우 시간과 횟수를 조절하여 완전히 제거한다.
• 2) 마찬가지로 크라이오 섹션을 통해 샘플을 만든 경우 자일렌의 과정 없이 봉입을 진행한다.
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• 필요시약
1. Hematoxylin / 2. Eosin / 3. 95% Ethanol / 4. Xylene
2. Alcian Blue Staining
1. 준비
a. Alcian Blue Solution
• 100% Acetic acid 용액을 증류수를 이용하여 3% 농도로 희석한다.
• Alcian Blue 8GX를 3% Acetic acid(pH2.5)를 이용하여 1%의 농도로 용해한다. (1g/100mL)
• 만들어진 Alcian Blue 8GX 용액을 차광된 상태에서 실온에 보관한다.
b. Nuclear Fast Red Solution
• Nuclear Fast Red 시약을 증류수를 이용하여 0.5%의 농도로 용해한다. (0.5g/100mL)
• Aluminum sulfate를 5%의 농도로 추가하여 용해한다. (5g/100mL)
• 혼합된 Nuclear Fast Red 용액을 70°C 항온조에 24시간 보관한다.
• 필터를 통해 불순물을 제거한 뒤 만들어진 Nuclear Fast Red 용액을 차광된 상태에서 실온에 보관한다.
2. 탈파라핀화
• 슬라이드를 자일렌에 1분씩 2회 담가 파라핀을 제거한다.
• 재수화를 위해 100, 90, 80, 70% 에탄올 및 증류수에서 각각 2분간 담가 세척한다.
3. 염색
• 슬라이드를 1% Alcian Blue 용액에 30분간 담가 염색한다.
• 염색 후 3% Acetic acid, 증류수에서 각각 2분간 담가 세척한다.
4. 대조 염색
• 슬라이드를 Nuclear Fast Red 용액에 3분간 담가 염색한다.
• 염색 후 증류수에서 2분간 담가 세척한다.
5. 탈수 및 봉입
• 탈수를 위해 70, 80, 90, 100% 에탄올 및 자일렌에서 각각 2분간 담가 세척한다.
• 자일렌이 완전히 마르기 전 소수성 봉입제를 사용하여 봉입한다.
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• Alcian Blue를 통한 파란색으로 산성 점액 다당류를 염색
• Nuclear Fast Red를 통한 붉은색으로 핵을 염색
• 필요시약
1. Alcian Blue 8GX / 2. Acetic Acid / 3. Aluminum Sulfate / 4. Nuclear Fast Red / 5. Xylene
3. Safranin-O Staining
1. 준비
a. Safranin-O Solution
• Safranin-O를 증류수를 이용하여 0.1%의 농도로 용해한다. (0.1g/100mL)
b. Fast Green Solution
• Fast Green을 증류수를 이용하여 0.1%의 농도로 용해한다. (0.1g/100mL)
2. 탈파라핀화
• 슬라이드를 자일렌에 1분씩 2회 담가 파라핀을 제거한다.
• 재수화를 위해 100, 90, 80, 70% 에탄올 및 증류수에서 각각 2분간 담가 세척한다.
3. 염색
• 슬라이드를 0.1% Safranin-O용액에 30분간 담가 염색한다.
• 염색 후 증류수에 2분간 담가 세척한다.
4. 대조 염색
• 슬라이드를 Fast Green용액에 2분간 담가 염색한다.
• 염색 후 1% Acetic acid에서 1분간 담가 세척한다.
5. 탈수 및 봉입
• 탈수를 위해 70, 80, 90, 100% 에탄올 및 자일렌에서 각각 2분간 담가 세척한다.
• 자일렌이 완전히 마르기 전 소수성 봉입제를 사용하여 봉입한다.
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• Safranin-O를 통한 붉은색으로 프로테오글리칸을 염색
• Fast Green을 통한 녹색으로 배경 조직을 염색
• 필요시약
1. Safranin-O / 2. Acetic Acid / 3. Fast Green / 4. Xylene
4. Oil Red-O Staining
1. 준비
a. Oil Red-O Solution
• Oil Red-O를 Isopropanol을 이용하여 0.5%의 농도로 용해한다. (0.5g/100mL)
• 이후 증류수를 이용하여 60% Isopropanol 농도로 희석하여 사용한다.
b. 60% Isopropanol Solution
• Oil Red-O가 들어가지 않은 60% Isopropanol 용액을 따로 제조한다.
c. Hematoxylin Solution
• Hematoxylin을 증류수를 이용하여 0.5%의 농도로 용해한다. (0.5g/100mL)
• Aluminum sulfate를 5%의 농도로 추가하여 용해한다. (5g/100mL)
• 혼합된 Hematoxylin 용액을 70°C 항온조에 24시간 보관한다.
• 필터를 통해 불순물을 제거한 뒤 만들어진 Hematoxylin 용액을 차광된 상태에서 실온에 보관한다.
2. 염색
• 슬라이드를 60% Isopropanol 용액에 10분간 담근다.
• Oil Red-O 용액에 10분간 담가 염색한다.
• 염색 후 증류수에 2분간 담가 세척한다.
3. 대조 염색
• 슬라이드를 Hematoxylin 용액에 2분간 담가 염색한다.
• 염색 후 증류수에 2분간 담가 세척한다.
5. 탈수 및 봉입
• 물이 마르기 전 친수성 봉입제를 사용하여 봉입한다.
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• Oil Red-O를 통한 붉은색으로 지방을 염색
• Hematoxylin을 통한 파란색으로 핵을 염색
• Oil Red-O Staining의 경우 소수성 지방을 염색하기 때문에 파라핀이 아닌 크라이오 섹션을 하며,
이러한 이유로 자일렌과 에탄올을 이용한 탈파라핀화 및 수화 과정이 필요하지 않음.
• 필요시약
1. Oil Red-O / 2. Isopropanol / 3. Hematoxylin / 4. Aluminum Sulfate / 4. Hematoxylin
