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tFNA-Aptamer 개념 정리

2025년 03월 10일 /

tFNA (tetrahesidral Framenetwork Nucleic Acid)

기본 개념

  • 정사면체 구조를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA, single strand DNA) 구조체
  • 생체 내에서 구조적인 안정성을 가짐
  • 일반적으로 20~80bp(base pair)의 ssDNA를 이용하며, 이에 따라 한 모서리의 길이가 5~20nm임
  • ssDNA는 말단에서 5~10bp의 혼성화(Hybridization)을 통해 triplex DNA 구조를 이룸
  • 말단 Triplex DNA 구조로 인해 자가조립(Self-Assembly) 과정을 통해 정사면체 구조를 형성함
  • CvME(Caveoline-Mediate Endocytosis)를 통해 비특이적(Cv 의존) 세포 흡수가 가능함
  • 엔도좀의 낮은 pH 환경에서 표면 전하 및 구조적 변화가 나타나며 이로 인해 엔도좀 막과 상호작용하여 엔도좀 탈출을 유도함

합성 과정

  1. Denaturaion. 95°C, 10min, 20°C/min : ssDNA의 2차 구조 풀어내는 과정
  2. Annealing. 60°C, 30min, 1°C/min : tFNA에 따라 유동적, 혼성화 및 자가조립 진행 단계
  3. Incubation. 20°C, 60min. 0.5°C/min : 반응 안정화 단계

Aptamer

기본 개념

  • 특정 타겟(단백질, 세포 등)과 높은 선택성을 가지고 결합하는 단일가닥 DNA 혹은 RNA
  • 자연적인 뉴클레오타이드(A, T, C, G)뿐만 아니라 변형된 뉴클레오타이드를 포함함
  • 항체와 비교하여 작은 크기, 용이한 합성, 낮은 면역원성, 높은 안정성, 높은 세포막 투과성의 장점이 있음
  • 평소 일부만 2차 구조를 가지는 사슬 형태지만 표적과 결합하며 2~3차 구조를 형성함
  • 항체, 효소-기질, 수용체-리간드와 비교했을 때 높은 결합력(Kd*, Dissociation Constant, 해리상수)를 가짐

SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)
: 무작위로 생성된 수많은 ssRNA/DNA 라이브러리 중 특정 표적과 강하게 결합하는 서열을 분획하는 과정

  1. 무작위 ssRNA/DNA를 비표적 물질과 반응시켜 비특이적 결합 서열을 제거함
  2. 이후, 표적 물질과 반응시켜 표적 물질과의 결합력이 강한 압타머 후보군을 선별함
  3. 압타머-표적 물질 복합체에서 결합력이 강한 압타머를 회수**한 뒤 증폭 과정(PCR)을 진행함
  4. 위 과정을 반복하며 표적 물질과 결합력이 가장 강한 압타머를 선별함
  5. 최종적으로 선별된 압타머를 분석(차세대 염기서열분석, Sanger Sequencing)하고 검증함

* Kd, Dissociation Constant, 해리상수
: 압타머와 표적의 결합력을 나타내는 값으로 Kd값이 낮을수록 결합력이 강함

** 압타머 회수

1. 온도 변화
: 70~90℃ 가열을 통해 압타머가 결합한 단백질을 변성시켜 압타머와의 결합을 깨뜨리고
원심분리를 통해 상층액에 존재하는 압타머를 회수함
> 변성 및 열에 민감한 사이드 이펙트 발생 가능성이 있음

2. 경쟁적 용출
: 압타머보다 결합력이 높은 리간드를 사용하여 회수함. 가장 정밀하고 안정적이나 비용이 많이 듦

3. RNase 혹은 알칼리 처리
압타머 변성 가능성이 있어 비선호 됨

tFNA-Aptamer-Drug

: tFNA 구조에서 혼성화가 이루어진 말단에 압타머(외 TGF-β, BMP와 같은 약물)의 합성이 가능함.

a. 흡수 경로
– tFNA=CvME / TGF-β, BMP=CME
– 타겟팅을 위한 Aptamer 및 약물은 CME 경로인 반면, tFNA는 CvME 경로*이기에 Aptamer의 타겟팅 능력이 감소됨.
– 또한 tFNA의 구조적 영향으로 인해 Aptamer 및 약물의 안정성이 증가하지만 같은 이유로 Aptamer의 타겟팅 능력이 감소됨.

* 골, 연골 환경 내 CvME 경로 반응 세포 순위
내피세포>골수 줄기세포>섬유아세포>골아세포, 연골세포>골세포>파골세포

b. 엔도좀 탈출 효율

c. tFNA, Aptamer, BMP, TGF-β 구조 비교

tFNAAptamerBMP(2, 7)TGF-β(1, 3)
크기(nm)5~201~34~52~3
분자량(kDa)10~505~1526~2825
형태정사면체ssDNA/RNA단백질 이합체단백질 이합체
안정성(효소 분해)높음낮음중간중간

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