TRIzol RNA 추출 프로토콜

TRIzol RNA extraction

1. 세포 분리

 • 96well plate 내 TRIzol을 각각 100µL를 넣고 피펫팅하여 세포를 용해시킨다.

 • 세포가 용해된 TRIzol용액을 멸균된 1.5mL EP tube에 옮겨 담는다.

 • EP tube에 Chloroform(4℃)을 20µL 추가한다.¹⁾

 • EP tube를 15초간 inverting하여 용액이 잘 섞이도록 한다.

 • 2-3분 동안 실온에서 보관 후 12,000xg, 15min, 4°C 조건에서 원심분리한다.

 • 원심분리 후 분리된 세 개의 층을 확인한다.²⁾

2. RNA 분리

 • 상층의 수용성 상(투명한 액체)을 새 EP tube로 옮긴다.³⁾

 • EP tube에 Isopropanol을 500µL를 추가한다.

 • EP tube를 15초간 inverting하여 용액이 잘 섞이도록 한다.

 • 2-3분 동안 실온에서 보관 후 12,000xg, 10min, 4°C 조건에서 원심분리한다.

 • 원심분리 후 EP tube 바닥에 침전된 RNA 펠렛을 확인한다.

3. RNA 세척

 • 상층액을 제거한 후, RNA 펠렛을 70% 에탄올(-20℃) 1mL를 넣는다.

 • RNA 펠렛을 튜브 벽에 붙인 상태로 7500xg, 5min, 4°C 조건에서 원심분리한다.

 • RNA 세척 과정을 2회 반복한다.

4. RNA 펠렛 용해

 • 20-50µL RNase-free water를 넣고 건조된 RNA 펠렛이 완전히 용해되도록 피펫팅한다.

5. RNA 순도 확인

 5.1. NanoDrop 기기를 활용하여 260nm 파장에서 RNA의 농도를 측정한다.

 5.2. RNA를 RNase-free water에 희석하여 260 nm와 280 nm에서의 흡광도⁴⁾ 비율을 사용한다.

  • 순수한 RNA일수록 260/280의 비율이 2.0에 가깝다.

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 • 1) Chloroform은 보통 TRIzol의 1/5 부피만큼 추가한다.

 • 2) 상층: 수용성 상 (RNA가 포함됨) / 중간층: 인터페이스 (DNA가 포함됨) / 하층: 유기상 (단백질과 지질이 포함됨)

 • 3) 중간층의 인터페이스를 함께 옮기는 경우 DNA로 인해 RNA의 순도가 낮아져 샘플의 가치가 사라진다.

 • 4) 260 nm는 핵산(DNA, RNA)의 흡광 파장이고, 280 nm는 단백질의 흡광 파장이다.